Échantillon microfantôme à diffusion 3D pour évaluer la précision quantitative des techniques de microscopie de phase tomographique

May 30, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 19586 (2022) Citer cet article

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Dans cet article, nous présentons une structure de diffusion biomimétique structurellement complexe, fabriquée par polymérisation à deux photons, et utilisons cet objet afin de comparer un système d'imagerie informatique. Le fantôme permet d'adapter la diffusion en modifiant ses degrés de liberté, c'est-à-dire le contraste de l'indice de réfraction et les dimensions de la couche de diffusion, et intègre un test de qualité d'imagerie 3D, représentant une seule cellule dans le tissu. Bien que l’échantillon puisse être utilisé avec plusieurs techniques de microscopie 3D, nous démontrons l’impact de la diffusion sur trois méthodes de reconstruction par microscopie tomographique en phase (TPM). L’une de ces méthodes suppose que l’échantillon est à faible diffusion, tandis que les deux autres prennent en compte la diffusion multiple. L'étude est réalisée à deux longueurs d'onde (visible et proche infrarouge), qui servent de facteur d'échelle pour le phénomène de diffusion. Nous constatons que le changement de longueur d'onde du visible au proche infrarouge a un impact sur l'applicabilité des méthodes de reconstruction TPM. En raison de la diffusion réduite dans la région proche infrarouge, les techniques orientées vers la diffusion multiple sont en fait moins performantes qu'une méthode destinée aux échantillons à faible diffusion. Cela implique la nécessité de sélectionner une approche appropriée en fonction des caractéristiques de diffusion de l'échantillon, même en cas de changements subtils dans l'interaction objet-lumière.

L’un des défis modernes de l’optique informatique consiste à imager des échantillons diffusés avec une haute résolution1. Cela peut être attribué au fait que les structures biologiques complexes telles que les sphéroïdes ou les organoïdes ont tendance à être des modèles plus pertinents que les cultures cellulaires 2D, par exemple pour la découverte de médicaments2. En outre, la plupart des techniques d'imagerie in vivo nécessitent que la lumière de sondage traverse la structure complexe d'un tissu, ce qui limite fortement les profondeurs d'imagerie en raison de la diffusion multiple. Cette demande stimule le développement de nouvelles méthodes1,3,4,5, cependant, il est difficile d'en sélectionner une appropriée en fonction de la force de diffusion de l'échantillon analysé. Pour cette raison, une méthode polyvalente, reproductible et quantitative pour l'évaluation de différents systèmes et algorithmes d'imagerie est essentielle pour déterminer leurs limites d'applicabilité en fonction des propriétés de diffusion de l'objet. Une possibilité consiste à utiliser des microfantômes calibrés comme cibles d’imagerie. Malheureusement, les microfantômes existants sont généralement soit à faible diffusion (par exemple, microsphères à indice correspondant), soit trop simplistes (par exemple, microsphères à indice non adapté)6,7 par rapport aux types d'échantillons multicellulaires à diffusion hétérogène auxquels sont destinées les méthodes de diffusion multiple. Il s'agit d'une limitation critique lors de la caractérisation des méthodes d'imagerie informatique utilisant des solveurs non convexes, où la convergence itérative dépend de la complexité du paysage énergétique et est directement associée à la complexité 3D d'un échantillon8.

Dans ce travail, nous présentons un microfantôme imprimé en 3D avec une distribution d’indice de réfraction (RI) à diffusion multiple. Pour ce faire, nous exploitons les développements récents en matière d’impression 3D via l’écriture laser directe9,10,11,12. Parmi les multiples techniques d’impression 3D disponibles13,14,15,16,17,18, nous avons choisi une polymérisation à deux photons qui permet l’impression 3D d’échantillons microfantômes avec une géométrie connue et un RI calibré. Par rapport à d'autres implémentations d'écriture laser directe, cela permet (1) de contrôler le RI avec une plage de modulation relativement élevée, (2) d'ajuster le contraste du RI ou la force de diffusion après fabrication en utilisant différents liquides d'immersion et (3) de gérer et mesurer le microfantôme de la même manière que les échantillons biologiques. Nous présentons ensuite l’application du fantôme dans le domaine de la microscopie tomographique de phase (TPM), une technique qui a démontré des résultats impressionnants en imagerie biologique dans des travaux antérieurs. Cependant, il est important de noter que toutes les méthodes d’imagerie informatique peuvent être évaluées avec la procédure proposée.